Technique d’étude des protéines

  1. Isoler une protéine
  1. Isoler l’organite
  1. Centrifugation différentielle à partir d’un homogénat cellulaire

Basse vitesse

Moyenne vitesse

Haute vitesse

Très haute vitesse

  1. Purification de l’organite par ultracentrifugation en gradient de densité

- Depot du culot sur gradient de densité (ladensité augmente avec la profondeur)

- Centrifugation courte et à très haute vitesse pour séparer les organites d’origine différente qui s’arrêtent quand la densité est la leur

- Collecteur de fraction (+ lourd en premier)

  1. Extraire les protéines totales à partir de l’organite purifié

Propriété d’insolubilité des protéines dans des solutions salines de concentration élevée.

  1. Séparation des protéines

En fonction de la charge :

- électrophorèse

- chromatographie par échange d’ions

En fonction de la taille (ou poids moléculaire) :

    • chromatographie par filtration sur gel (ou par gel d’exclusion)
    • electrophorèse SDS-PAGE

En fonction de l’absorption spécifique :

    • chromatographie d’affinité
  1. Chromatographie

Séparation des protéines selon leur migration différentielle à travers un système composé de 2 phases : phase fixe (gel, billes,…) + phase mobile (solution tampon, gaz)

    • Chromatographie par gel filtration

Phase fixe : mélange de billes poreuses qui forment un gel (avec des diamètres précis), plus la molécule est petite, plus elle est retardée. En premier arrive les poids moléculaires élevés et en dernier les poids moléculaires les plus petits.

Volume d’élution : quantité de tampon nécessaire pour récupérere chaque protéine

Volume mort : quantité de tampon nécessaire pour faire parvenir la première protéine du haut vers le bas = volume de tampon entre les billes

Dc Volume d’élution = Volume total – Volume mort

Plus le volume d’élution est petit, plus le poids moléculaire est élevé.

    • Chromatographie d’affinité

Il s’agit d’une méthode très spécifique

Phase fixe : billes qui lient un substrat de façon covalente, la protéine et le substrat se lient de façon covalente

Cette technique ne peut se faire qu’avec 2-3 protéines

    • Chromatographie par échange d’ions

Phase fixe : billes chargées négativement ou positivimement

La séparation se fait en fonction de la charge globale de la protéine

  1. Electrophorèse
    • Electrophorèse simple

Séparation selon la charge, déplacement des particules chargées dans un champ électrique

    • pH inférieur au pHi : protéines chargées positivement, cations
    • pH supérieur au pHi : protéines chargées négativement, anions

Le pH est donné par la solution d’électrophorèse

La distance de migration des acides aminés et d’autant plus élevée que la différence entre le pHi et le pH du tampon est élevée.

    • Electrofocalisation

Séparation en fonction du pHi

Gradient de pH sur gel et les protéines au fur et à mesure changent de charge,

et quand pH = pHi la protéine focalise (c’est-à-dire s’immobilise)

C’est une technique précise car sépare strictement en fonction du pHi

    • Electrophorèse SDS-PAGE

Séparation en fonction du poids moléculaire

PAGE : gel de plyacrylamide (réseau de mailles plus ou moins larges)

SDS : (sodium dodécyl sulfate) détergent, lipide avec propriété de se fixer très fortement aux protéines et chargé négativement, attaque les liaisons hydrophobes et coupe les liaisons faibles. Donc dissocie les protéines, les rends négativement chargées, donc dénaturation de la protéine et pas de conservation de sa structure native.

Champ électrique : migration de la cathode (-) à l’anode (+), les poids moléculaires les plus faibles migrent plus vite, les poids moléculaires les plus élevés arrivent à l’anode en dernier

    • Electrophorèse bi-dimensionnelle

1ère dimension : électrofocalisation (en fonction pHi)

2ème dimension : SDS-PAGE (en fonction poids moléculaire)

Permet l’étude du protéome (= toutes les protéines), approche protéomique

On peut caractériser toutes les protéines

Un point = 1 protéine définie avec son pHi et son poinds moléculaire

  1. Analyser la composition chimique d’une protéine
  1. Deux méthodes pour couper les liaisons peptidiques
    • Méthode chimique

HCl concentré : coupe tout les acides aminés

    • Méthode enzymatique / peptidase

Endopeptidase (coupe dans la chaine) : – trypsine (coupe à droite lysine et arginine)

- chymotrypsine (coupe à droite des acides aminés aromatiques)

Exopeptidase (coupe aux extremités) : – aminopeptidase (N-term)

- carboxypeptidase (C-term)

  1. Analyse de la composition chimique d’une protéine

Découper la protéines en petites unités (=peptides)

Composition chimique = acides aminés (différent de la séquence d’une protéine !!)

Spectrométrie de masse : donne la masse précise d’une molécule, donc les peptides sont séparés en fonction de leur masse moléculaire

Approche avec précise la composition en acides aminés

  1. Analyser la séquence d’une protéine

On découpe la protéine de façon séquencée = structure primaire

On utilise aussi la spectrométrie de masse, la différence de masse entre 2 fragments correspond à la masse d’un acide aminé

  1. Structure spatiale d’une protéine

La méthode est la diffraction des rayons X

Conditions : – protéine purifiée

- protéine sous forme de cristal

1. Cristal irradié sous diffèrents angles par une source de rayons X

2. On receuille l’émission diffractée sur un écran sensible = profil de diffraction

3. Reconstruction informatique des données pour avoir des cartes de densité électronique

4. Porudction d’un modèle en trois dimensions à l’aide des cartes

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